Giunsa pagpalambo ang pagkasensitibo sa reaksyon sa RT-PCR alang sa pagkakita sa RNA

Sa proseso sa pagpahigayon sa genetic nga mga pagtuon, kasagaran kita makasugat sa dili igo nga RNA samples, alang sa panig-ingnan, alang sa pagtuon sa gagmay nga anatomical oral tumor, bisan single-cell sample, ug mga sample sa piho nga gene mutation nga gi-transcribe sa ubos kaayo nga lebel sa mga selula sa tawo.Siyempre, alang sa pagsulay sa COVID-19, kung ang mga swab wala sa husto nga lugar o dili igo nga oras sa sampling, ang gidak-on sa sample gamay ra kaayo, mao nga ang Commission of Health and Family Planning migawas duha ka adlaw ang milabay ug nakapasar sa pagsulay, ug kung ang nucleic acid sampler wala mokuha ug unom ka sample, mahimo nimo kining i-report.

Importante ang pagkasensitibo sa reagent tungod kay aduna kita niini nga problema o kana nga problema, busa unsa may atong mahimo aron mapalambo ang pagkasensitibo sa RT-PCR?

Sa dili pa nato hisgutan ang mga posibleng solusyon, atong hisgotan ang duha ka dagkong komplikasyon sa sitwasyon nga bag-o pa natong gihisgutan.

Una sa tanan, nabalaka kami bahin sa pagkawala sa RNA kung kami adunay pipila ra nga populasyon sa cell sa among sample.Kung gigamit ang tradisyonal nga mga pamaagi sa pagbulag ug paglimpyo, sama sa pamaagi sa kolum o pamaagi sa pag-ulan sa nucleic acid, adunay taas nga posibilidad nga mawala ang pipila nga mga sample.Usa ka solusyon mao ang pagdugang ug molekula sa carrier, sama sa tRNA, apan bisan pa niana, walay garantiya nga OK ra ang among eksperimento sa pagbawi.

Busa unsa ang mas maayo nga paagi?Ang usa ka maayong kapilian alang sa mga kultura nga mga selula o microanatomical sample mao ang paggamit sa direkta nga lysis.

Ang ideya mao ang pagbahin sa mga selula sulod sa 5 ka minuto, buhian ang RNA ngadto sa solusyon, unya ihunong ang reaksyon sulod sa 2 ka minutos, dayon idugang ang lysate direkta ngadto sa reverse transcription reaction aron walay RNA nga mawala, ug sa katapusan ibutang ang resulta nga cDNA direkta ngadto sa real-time nga reaksyon.

Apan unsa kaha kung, tungod sa limitado nga punto sa pagsugod o gamay nga kantidad sa target nga ekspresyon sa gene, mahimo naton i-recycle ang tanan nga RNA ug dili gihapon makahatag igo nga mga templates aron makakuha usa ka maayong real-time nga signal?

Sa kini nga kaso, ang lakang sa pre-amplification mahimong mapuslanon kaayo.

Ang mosunud usa ka laraw aron madugangan ang pagkasensitibo pagkahuman sa reverse transcription.Sa dili pa magsugod, kinahanglan natong pangutan-on ang downstream kung unsang mga target ang atong interesado, aron sa pagdesinyo sa piho nga mga primer para niini nga mga target para sa pre-amplification.

Mahimo kini nga makab-ot pinaagi sa paghimo sa usa ka sinagol nga primer nga adunay hangtod sa 100 ka parisan sa mga primer ug usa ka siklo sa reaksyon nga 10 hangtod 14 ka beses.Busa, gikinahanglan ang usa ka Master Mix nga espesipikong gidisenyo alang niini nga kinahanglanon aron madugangan pa ang nakuha nga cDNA.

Ang hinungdan sa pagtakda sa gidaghanon sa mga siklo tali sa 10 ug 14 mao nga kini nga limitado nga gidaghanon sa mga siklo nagsiguro sa pagkalainlain tali sa lainlaing mga target, nga hinungdanon alang sa mga tigdukiduki nga nanginahanglan quantitative molekular nga impormasyon.

Human sa pre-amplification, makakuha kita ug dakong kantidad sa cDNA, aron ang pagkasensitibo sa detection sa back-end mapalambo pag-ayo, ug mahimo pa gani nato nga matunaw ang sample ug makahimo og daghang real-time nga mga reaksyon sa PCR aron mawagtang ang posible nga mga random error.